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教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本制備篇(續)

 WB實驗流程

 

 

 

樣本制備的步驟

 

 

關于樣本采集和保存,蛋白提取的相關

知識和技巧請查看︰

 

接下來,讓小編帶您總結關于蛋白定量和蛋白變性相關的知識點︰

 

蛋白定量

測定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法Lowry法Bradford法(考染法)

 
 

1. BCA法的測定原理是蛋白質將銅離子還原成亞銅離子,後者在堿性溶液中與BCA結合生成紫紅色結合物,該復合物在562nm處有吸光值且與蛋白質濃度成正相關性,據此可測定蛋白質濃度。考馬斯亮藍在游離狀態下呈紅色,最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合後變為青色,蛋白質—色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。

 
 

 

 
 

2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法,首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物,然後這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚上級),產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色,這種深藍色的復合物在745~750nm處有最大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比,可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。

 
 

 

 
 

3. Bradford法又稱為考染法。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高,可檢測到微量蛋白,操作簡便,試劑配制極簡單,重復性好,但干擾因素多。考馬氏亮藍G-250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色,當它通過疏水作用與蛋白質結合後,變成藍色,最大吸收波長從465nm轉移到595nm處,在一定的範圍內,蛋白質含量與595nm的吸光度成正比,測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

 
 

 

三者之中,Lowry法與BCA同屬化學法,Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測定方法,但是操作繁瑣,實驗時間長。BCA法操作簡單,時間短,形成的顏色復合物穩定性強,但可能受一些雜質影響。Bradford屬于染料結合法,也易受到去垢劑影響。

 

蛋白變性

蛋白變性常用方式是高溫煮樣,煮樣條件設置為100℃,根據樣品量的多少,設置時間5~15min,煮樣時間過長,一些蛋白可能會產生聚集性沉澱。疏水性極強的蛋白質,如含有多個跨膜結構域的蛋白質,在煮沸時可能會發生聚集或寡聚化,因此,其煮樣條件為40℃~55℃條件下,溫浴10~60min變性。煮樣後的樣本于-20℃或-80℃保存。

提取並定量後,並未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品,保存于-80℃時,防止反復凍融,並盡量于1周內加Loading Buffer煮樣處理,不要超過2周。

 

在此,為了幫您更好地完成實驗,我們推薦平安彩票高頻彩官網蛋白定量和蛋白變性相關的配套棋牌游戲撲克。

棋牌游戲撲克名稱

棋牌游戲撲克貨號

Bradford法蛋白濃度測定試劑盒

PC0010

BCA蛋白濃度測定試劑盒

PC0020

Lowry法蛋白濃度測定試劑盒

PC0030

4×蛋白上樣緩沖液

(含DTT)

P1015

4×蛋白上樣緩沖液

(含巰基還原劑)

P1016

4×非變性蛋白上樣緩沖液

P1017

 

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